体外碱性成纤维细胞生长因子聚乳酸纳米缓释微球对人脂肪干细胞增殖和成脂分化的影响

目的 体外观察碱性成纤维细胞生长因子(basie fibroblast growth factor,bFGF)聚乳酸纳米缓释微球对人脂肪干细胞增殖和成脂分化的影响,为bFGF缓释微球应用于脂肪组织工程的研究提供理论依据.方法 体外分离培养脂肪干细胞,并行多向诱导分化鉴定.配制含有0、1、2、3、4、5 mg/ml bFGF聚乳酸缓释微球的脂肪干细胞培养液及成脂分化诱导液.将脂肪干细胞接种至96孔板,第2天更换含不同浓度hFGF缓释微球的培养液和成脂诱导液,分别用四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)和油红O定量检测法定期检测细胞增殖和成脂分化的情况.所得数据均用SPSS13.0软件进行统计学处理.结果 bFGF聚乳酸缓释微球有明显促进脂肪干细胞增殖和成脂分化的作用.增殖实验和成脂诱导实验合适的作用浓度分别为3 mg/ml和4 mg/ml.结论 bFGF聚乳酸纳米缓释微球体外可以明显促进脂肪下细胞的增殖和成脂分化,可作为一种较理想的细胞因子缓释系统应用于脂肪组织工程的研究.     

葡茶多酚对尿酸诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1表达的影响

目的研究葡茶多酚对尿酸诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1表达的影响。方法培养分离肾小管上皮细胞,分对照组、尿酸组、葡茶多酚组（在尿酸干预基础上,分别加入终浓度为0．2、0．4、0．8mg／L的葡茶多酚）共5组,MTT法测细胞增生率、TUNEI。测凋亡率、ELISA测TGF-β1分泌,RT-PCR测TGF-β1mRNA表达。结果与尿酸组相比,加入葡茶多酚干预后,肾小管上皮细胞增生率明显增高（P〈0．01）,葡茶多酚干预浓度愈高,肾小管上皮细胞增生率则愈高;葡茶多酚各浓度组在任一时间点凋亡率均明显低于尿酸组,差异有显著意义;葡茶多酚各浓度组之间相比,浓度愈高,则培养细胞凋亡率愈低,差异有显著意义,尿酸作用时间愈长,则培养细胞凋亡率愈高;葡茶多酚各浓度组在任一时间点培养上清TGF-β1浓度均明显降低,差异有显著意义;葡茶多酚各浓度组之间相比,浓度愈高,则培养上清TGF-β1浓度愈低,差异有显著意义,尿酸作用时间愈长,则培养上清TGF-β1浓度愈高;葡茶多酚各浓度组在任一时间点培养上清TGF-β1mRNA表达均明显降低,差异有显著意义;葡茶多酚各浓度组之间相比,浓度愈高,则培养上清TGF-β1mRNA表达愈低,但0．2mg／L葡茶多酚组与0．4mg／L葡茶多酚组、0．4mg／L葡茶多酚组与0．8mg／L葡茶多酚组差异无显著意义,0．2mg／L葡茶多酚组与0．8mg／L葡茶多酚组之间差异有显著意义,尿酸作用时间愈长,则TGF-β1mRNA表达愈高。结论高尿酸能抑制肾小管上皮细胞的增生,减少肾小管上皮细胞的凋亡及TGF-β1的表达与分泌。     

人端粒酶逆转录酶基因转染人髓核细胞的安全性研究

目的评价人端粒酶逆转录酶（humantelomerasereverse transeriptase,hTERT）基因转染对人椎间盘髓核细胞“安全性”的影响．方法将构建好的重组腺相关病毒人端粒酶逆转录酶基因（recombinantadeno—associatedvirusvee—tor—nlediatedhTERTgene,rAAV—hTERT）按感染复数（muhiplieityofinfection,MOI）10^5v．g每细胞转染体外培养二代髓核细胞。没立rAAV—hTERT转染组,AAV空病毒转染组及未转染组;利用RT—PCR及Western—blot检测转染后hTERT基闪的表达;对体外培养120d的细胞进行染色体核型分析;将3组细胞（100μL,3×10^7／mL）分别注入裸鼠腋下检测其成瘤性,以人Hela细胞为阳性成瘤实验对照。结果成功检测出rAAV—hTERT转染髓核细胞后hTERT轼因的表达;G-带核型分析未见染色体结构异常克隆;3组细胞均未观察到裸鼠体内肿瘤形成。结论rAAV—hTERT能成功转染人惟问盘髓核细胞并IF确表达,rAAV—hTERT转染髓核细胞在有限的体外培养过程中是安全的,可为进一步的在体研究提供安伞性证据.     

脐带间充质干细胞对重度烧伤大鼠肾脏保护作用的研究

目的：观察脐带间充质干细胞（UCMSCs）移植对大鼠严重烧伤后肾脏损伤的影响,为干细胞应用于烧伤后的脏器保护研究奠定基础。方法：获取并分离培养孕大鼠UCMSCs并用流式细胞技术鉴定细胞表面抗原。48只SD大鼠随机分为4组：正常对照组（n=12）、生理盐水组（n=12）、乌司他丁组（n=12）和UCMSCs组（n=12）。正常对照组不作任何处理,立即活杀取材;其余3组制备20％TBSAIII度烧伤模型（98℃,12s）,于伤后48h分别静脉注射生理盐水0．1ml／g（生理盐水组）、乌司他丁1．6×105U／kg（乌司他丁组）和UCMSCs106／k（uCMSCs组）,于给药后7、14d观察大鼠肾脏组织病理学,免疫组化法观察组织凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,并进行血尿素氮（BUN）、肌酐（cr）水平的测定。结果：烧伤后7、14d的组织病理学观察显示,干细胞移植后的大鼠烧伤后肾脏组织充血、肿胀等病理学改变较乌司他丁组及生理盐水组有所减轻,随时间延长减轻更加明显;免疫组化观察显示UCMSCs组伤后7d和14d肾组织中Bcl-2的表达较乌司他丁组和生理盐水组明显增多,表明肾组织抗凋亡能力增强。大鼠烧伤后BUN和Cr均较正常对照组显著升高。乌司他丁治疗组除14dBUN较生理盐水组升高外,其余时间BUN和Cr均明显下降。UCMSCs组伤后7和14d两肾功能指标均明显下降,与生理盐水组和乌司他丁组比较差异均有显著性（P〈0．05）,显示干细胞治疗对肾功能有明显改善作用。结论：UC—MSCs移植可有效减轻重度烧伤后大鼠‘肾脏组织的损伤并改善肾脏功能。     

蜕皮甾酮对人脐带间充质干细胞冻存复苏后生物学活性的影响

目的：研究体外条件下蜕皮甾酮（EDS）对冻存复苏后人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）生物学活性的影响。方法：hUCMSCs采用梯度冷冻技术冻存,6个月后复苏,扩增、传代,分3组培养：空白对照组用普通培养基培养;低剂量EDS组在普通培养基中加入100μg／mlEDS;高剂量EDS组在普通培养基中加入200μg／mlEDS。显微镜下观察细胞形态,10d时计算克隆形成能力,绘制细胞生长0～7d的细胞生长曲线,流式细胞仪鉴定hucMscs的细胞表面特异标记（CD34、CD45、CD29、CD105）,油红0染色及茜素红染色观察huCMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力。结果：两EDS组克隆形成率约为75％,空白对照组约为40％。生长曲线显示两EDS组增殖速度较空白对照组快,但两EDS组增殖速度相近。流式检测结果显示两EDS组的CD29、CD105阳性率明显高于空白对照组,CD34、CD45里阴性表达,其表达明显低于空白对照组（P〈0．05）,两EDS组之间差异无统计学意义;成骨、成脂分化能力检测发现,各组细胞均能够向脂肪细胞、成骨细胞分化,而高剂量EDS组细胞在未加诱导培养基的情况下仍出现向成骨细胞分化的趋势。结论：在一定浓度范围内,EDS对细胞复苏后恢复细胞活性以及提高存活率方面具有积极作用,但是较高浓度的EDS有诱导细胞向成骨细胞方向分化的趋势。     

氨肽酶N/CD13在肝癌中的表达及意义

目的 探讨氨肽酶N/CD13在肝癌患者中的表达情况,探讨其与肝癌患者临床资料及预后的相关性.方法 应用免疫组化SP法,对40例肝癌患者肝癌组织、10例肝癌患者癌旁组织及10例肝血管瘤患者正常肝组织行单克隆抗体CD13检测.结果 40例(100％)肝癌组织均可见不同程度的CD13阳性表达,肝癌癌旁组织中3例(30％)出现CD13弱阳性表达,10例肝血管瘤患者标本未见表达.CD13表达量与患者的性别、年龄、血清AFP值、HbsAg、分化程度、Child分级及TNM分期差异无统计学意义(P＞0.05);而CD13的表达量与患者的血清AFP值、HbsAg、分化程度之间差异有统计学意义(P＜0.05).生存函数图发现CD13与患者生存时间呈反相关,但CD13表达量与患者肿瘤复发差异无统计学意义(P＞0.05).结论 CD13可作为肝癌干细胞的表面标志物,有望成为判断预后的有效指标.     

诱导型一氧化氮合酶与Cajal间质细胞在术后肠梗阻大鼠小肠中的表达及意义

目的 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与Cajal间质细胞(ICC)在术后肠梗阻大鼠小肠中的表达及意义.方法 选取健康成年Wistar大鼠30只,按照随机数字表法将其分为对照组和肠梗阻组,每组15只,检测两组大鼠的胃肠道传输速率;应用免疫组织化学染色法对两组大鼠小肠iNOS和c-kit的分布和表达进行观察,应用实时荧光定量PCR检测两组大鼠小肠c-kit和iNOS mRNA的表达.组间比较采用t检验.结果 肠梗阻组有2只大鼠因麻醉药物过量或低温死亡,最终进入结果分析的肠梗阻组大鼠为13只.肠梗阻组大鼠胃肠道传输速率为42％±14％,低于对照组大鼠的64％±13％(t=6.56,P＜0.05).免疫组织化学染色法结果显示,肠梗阻组大鼠小肠c-kit阳性细胞数为8.9±2.9,明显少于对照组大鼠的14.4 ±5.0(t =3.97,P＜0.05);肠梗阻组大鼠小肠iNOS阳性细胞表达明显增加,达到13.6±4.9,而对照组大鼠小肠几乎无iNOS阳性细胞;实时荧光定量PCR检测结果表明,术后肠梗阻组大鼠小肠c-kit和iNOS mRNA相对表达量分别为1.6±0.8和2.2±1.2,而对照组分别为2.6±1.1和0.5 ±0.5,两组比较,差异有统计学意义(t =2.86,4.61,P＜0.05).结论 大鼠术后肠梗阻发生过程中存在ICC分布减少而iNOS表达明显增加的现象,两者的变化可能在术后肠梗阻发生机制中发挥了重要作用.     

RNA干扰降低环氧化酶2基因表达对人胆管癌QBC939细胞的体外作用

目的研究小干扰RNA（siRNA）降低环氧化酶2（COX-2）基因对胆管癌QBC939细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白表达的影响。方法采用RNA干扰的方法,将胆管癌细胞株QBC939细胞分为4组：COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体、空白对照组。将COX-2 siRNA转染入QBC939细胞;流式细胞仪检测siRNA降低COX-2基因表达对凋亡的作用,WesternBlot法检测siRNA降低COX-2基因表达对caspase-3表达变化的影响。结果 RNA干扰后QBC939细胞COX-2表达下降至空白对照组的42%,流式细胞仪检测结果显示COX-2 siRNA干预组细胞的凋亡率以及凋亡蛋白caspase-3的表达明显高于其他3个对照组。结论 RNA干扰可抑制细胞COX-2蛋白的表达,促使胆管癌QBC939细胞的凋亡,caspase-3途径可能是其调控通路之     

人羊水间充质干细胞对乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th1／Th2的体外调节

目的探讨人羊水间充质干细胞（human amniotie fluid—derived mesenchymal stem cells,h-AFMsc）对乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th1／Th2的体外调节作用。方法选择2011年2—5月中山大学附属第三医院6例乙型肝炎肝衰竭患者和6名健康志愿者,提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuelear cells,PBMC）,同时从孕妇中期羊水中提取h-AFMSC。将h-AFMSC分别与乙型肝炎肝衰竭患者和健康捐献者的PBMC共培养72h,乙型肝炎肝衰竭患者和健康捐献者的PBMC单独培养组作为对照。应用流式细胞仪检测共培养前后不同组PBMCIFNγ（Th1）和IL-4（Th2）的变化情况,计算Th1／Th2比值。对共培养前后数据进行Mauchly球形检验,P〉0．1满足球形假设检验则采用重复测量方差分析。结果共培养72h,乙型肝炎肝衰竭患者PBMC与h—AFMSC共培养组的Th1细胞比例与其PBMC单独培养组比较无明显差异（F=0．82,P〉0．05）,但Th2细胞比例明显下降（F=10．24,P〈0．05）,从而导致Th1／Th2比值显著上升（F=17．28,P〈0．01）。健康捐献者PBMC与h-AFMSC共培养组的Th1、Th2和Th1／Th2比值与其PBMC单独培养组比较差异均不明显（F值分别为0．54、0．68和0．74,P值均〉0．05）。结论h-AFMSC对乙型肝炎肝衰竭患者的Th1／Th2有体外调节作用,具有作为移植种子来源移植治疗乙型肝炎肝衰竭的可能性。     

非清髓预处理后自体外周血造血干细胞移植治疗难治性重症肌无力远期疗效观察

目的观察体外纯化的自体外周血CD34+细胞移植于经非清髓预处理方案治疗的难治性重症肌无力(MG)患者的远期疗效。方法回顾性分析浙江中医药大学附属第一医院血液科2005年2月至2010年2月期间经纯化的自体外周血CD34+细胞移植治疗5例难治性MG患者资料。采用FAC预处理方案:磷酸氟达拉滨30mg·m-2·d-1,共4d;抗胸腺细胞球蛋白2.5mg·kg-1·d-1或抗淋巴细胞球蛋白30mg·kg-1·d-1,共4d;环磷酰胺50～60mg·kg-1·d-1,共2d。结果 5例患者均获造血、免疫重建,无移植相关死亡。全部患者均随访至2012年2月,中位随访时间44(24～84)个月,其中肌力正常,恢复正常生活、工作,脱离药物治疗4例,另1例移植后12个月因疾病复发而再次应用小剂量泼尼松、溴吡斯的明维持治疗患者目前肌无力症状控制良好,生活自理。结论 FAC预处理方案应用于纯化的自体外周血CD34+细胞移植治疗难治性MG远期疗效较好,患者的耐受性良好,值得进一步临床研究。+